Verschiedentlich, wie etwa in dem hier rezensierten Buch war davon die Rede, der Drosten-Test hätte in einem Vergleich mit anderen Testverfahren sehr schlecht abgeschnitten und es wäre seine Unbrauchbarkeit nachgewiesen worden. Im Interesse der Transparenz poste ich hier einmal mit minimalen Kürzungen den Wortlaut des betreffenden Reports mit Quellenangabe:


1. Einführung
Ein neues humanes Coronavirus namens schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist im Dezember 2019 in China aufgetaucht [1]. SARS-CoV-2 ist verantwortlich für die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die am 12. März 2020 von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) [2] zur Pandemie erklärt wurde. Bis zum 26. Mai 2020 wurden 5.404.512 Fälle gemeldet, darunter 343.514 Todesfälle [3]. Ein zuverlässiger diagnostischer Test ist entscheidend, um die Ausbreitung von SARS-CoV-2 zu begrenzen, da die Früherkennung neuer Fälle zur Patientenisolierung und Kontaktverfolgung führt. Das erste SARS-CoV-2-Genom wurde am 10. Januar 2020 [4] veröffentlicht und ermöglichte die schnelle Entwicklung eines Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktions-Assays (RT-PCR) der Charité [5,6]. Dieser Test war der erste, der von der WHO [7] versandt wurde und wurde weithin in klinischen Virologielaboratorien weltweit umgesetzt [8]. Seitdem hat die WHO [9] andere Ansätze veröffentlicht, die von Referenzlaboratorien entwickelt wurden, darunter HKU (Hongkong) [10,11], China CDC (China) [12], US CDC (USA) [13], und Institut Pasteur, Paris (Frankreich) [14]. Diese Assays umfassten mehrere RT-PCRs, die auf zwei oder drei verschiedene SARS-CoV-2-Genregionen abzielten, darunter RdRp (RNA-abhängige RNA-Polymerase), N (Nukleocapsid-Protein), E (Umschlagprotein), ORF1ab nsp10 (nicht-strukturelles Protein 10) und ORF1b nsp14 (nicht-strukturelles Protein 14). In der vorliegenden Studie wollten wir die Empfindlichkeit und Spezifität dieser verschiedenen RT-PCR-Assays vergleichen. Insgesamt schnitten die verschiedenen RT-PCR-Assays für die SARS-CoV-2-Erkennung gut ab und waren alle spezifisch, mit Ausnahme von N Charité, (Deutschland) und N2 US CDC (USA) Assays. RdRp Institut Pasteur (IP2, IP4), N China CDC und N1 US CDC wurden als die empfindlichsten Assays gefunden.
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2. Materialien und Methoden
2.1. Studiendesign
Zur Beurteilung der Empfindlichkeit wurden verschiedene RNA-Konzentrationen von SARS-CoV-2-Zellkulturüberstand sowie klinischen Proben mit unterschiedlichen Viruslasten(n = 4) mit allen RT-PCR-Assays getestet. Für die drei empfindlichsten Assays wurde die Nachweisgrenze (LoD) ermittelt und zusätzliche klinische Proben (n = 16) mit niedrigen Virusbelastungen getestet. Zur Beurteilung der Spezifität wurden klinische Proben, die für SARS-CoV-2 (n = 50) negativ waren, mit allen RT-PCR-Assays getestet. Alle klinischen Proben (nasopharyngeale Aspirate) wurden vom Hospices Civils de Lyon ? Universitätskrankenhaus, Frankreich, zur Verfügung gestellt und vor der Extraktion bei 80 °C eingefroren.
2.2. Empfindlichkeit
Die Empfindlichkeit für jeden RT-PCR-Assay wurde zuerst mit zehnfachen seriellen Verdünnungen von 10Nr. 3 bis 10Nr. 9 SARS-CoV-2 Zellkulturüberstande (eine Replikation für 10Nr. 3 und 10Nr. 4, drei Replikationen für 10Nr. 5 und 10Nr. 6und fünf Repliken für 10Nr. 7 bis 10Nr. 9). Vier positive klinische Proben wurden dann mit allen RT-PCR-Assays getestet, um diese Ergebnisse zu bestätigen.
Für die drei empfindlichsten Assays schätzten wir die LoD anhand einer Probitanalyse, indem wir fünf zusätzliche Repliken jeder Verdünnung der Zellkulturüberstandstoffe einbauten. Die Probitanalyse besteht darin, die Beziehung zwischen der Wahrscheinlichkeit der Detektion und der Konzentration mithilfe einer kumulativen Wahrscheinlichkeitskurve zu beschreiben. Für jede Verdünnung wird das Verhältnis (trefferrate) als Anzahl der Replikationen mit einem erkannten Ergebnis pro Gesamtzahl der getesteten Replikationen berechnet. Diese Trefferraten werden mathematisch in kumulative Normalwahrscheinlichkeitseinheiten (Probits) umgerechnet und mit einem Regressionsmodell im Vergleich zu ihren jeweiligen Konzentrationen angepasst. Die LoD ist definiert als die niedrigste Menge an viralem Genom, die mit einer Trefferrate von 95% nachgewiesen werden kann. Bei diesen drei empfindlichsten Assays wurden die mit der Probitanalyse erzielten Ergebnisse durch zusätzliche Tests von sechzehn klinischen Proben mit geringer Viruskonzentration bestätigt.
2.3. Spezifität
Die Spezifität für jeden RT-PCR-Test wurde anhand klinischer Proben (n = 50) bewertet, die negativ auf SARS-CoV-2 einschließlich klinischer Proben (n = 30), die positiv auf andere Atemwegsviren getestet wurden: humane Coronaviren 229E, OC43, HKU1 und NL63, humane Influenza-A- und B-Viren, Rhinovirus, respiratorische synzytiales Virus, Parainfluenzavirus, Adenovirus, Metapneumovirus und Picornavirus.
Die Untersuchung falsch-positiver Ergebnisse wurde mit zusätzlichen negativen klinischen Proben, Wasser und einer zusätzlichen klinischen Probe durchgeführt, die für jedes Ziel positiv getestet wurde. Die Amplicon-Größe wurde mit dem Agilent DNA 1000 Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) analysiert.


2.4. SARS-CoV-2 Zellkultur Multiplikationen
Zellkulturüberstandstoffe wurden aus einer positiven klinischen Probe gewonnen, die in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 an büffelgrünen Affenzellen angebaut wurde (Zelllinie der Université Louis Pasteur, Straßburg, Frankreich) [15]. Die SARS-CoV-2-Kultur hatte einen infektiösen Titer von 8,2710TCID50/mL nach der statistischen Methode Reed und Muench [16].
2.5. Extraktion und RT-PCR
Die RNA-Extraktion erfolgte nach Herstellerangaben über die EMAG-Plattform (bioMérieux, Marcy-l'Etoile, Frankreich). RT-PCR wurde nach veröffentlichten Anweisungen [5,6,10,11,12,13,14] durchgeführt, die in ®Tabelle 1; Tabelle 2. Da das China CDC-Protokoll keine Polymerase, Thermocycler, Volumen des Nukleinsäureextrakts und Amplifikationszyklen angibt, wurden die gleichen Anweisungen angewendet wie für den HKU-Test. RdRp IP2- und IP4-Assays vom Institut Pasteur, Paris (Frankreich) können multiplexiert oder in simplex [14] verwendet werden. Ein vorläufiger Vergleich mit SARS-CoV-2-Zellkulturüberstandhatungen ergab, dass RdRp IP4 bei Verwendung im Multiplex besser ablief, während IP2 nicht signifikant beeinflusst wurde (Zusatztabelle S1). Die CFX 96 Touch? Real-Time PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) wurde für alle RT-PCR-Assays verwendet.

Die für jeden Test ermittelten mittleren Zyklusschwellenwerte (Ct) wurden dann mit Verdünnungen 10 verglichen.Nr. 5 bis 10−8 (Abbildung 1, Zusatztabelle S2). Da die akzeptierte technische Variabilität von RT-PCR unter 0,510, betrachteten wir einen Unterschied von 2 Ct als signifikant [17]. Mit 10Nr. 5 Verdünnung war der niedrigste Ct-Wert 27,7 für RdRp IP4. Mit N1 und N3 US CDC und RdRp IP2 wurde kein signifikanter Unterschied bei den Ct-Werten (Ct von 28,0 bis 29,1) gemeldet. Ein ähnliches Ct-Profil wurde bei diesen Assays bei 10Nr. 6 und 10Nr. 7 Verdünnungen. Mit 10−8 Verdünnung, nur N Charité hatte deutlich höhere Ct-Werte (41,0 vs. 36,7 bis 39,0 für N China CDC, N1 und N3 US CDC, und Duplex RdRp IP2/IP4).
Klinische Proben (n = 4) wurden dann mit allen RT-PCR-Assays getestet, um die Ergebnisse zu bestätigen, die an SARS-CoV-2-Zellkulturüberstand(Zusatztabelle S3) erzielt wurden. ORF1b und N HKU, ORF1ab und N China CDC, N1 und N3 US CDC sowie RdRp IP2 und RdRp IP4 Assays haben alle vier positiven Proben erkannt. S und NS RdRp und N Charité Assays entdeckten die positive Probe nicht mit der niedrigsten Viruskonzentration.
Zusammengenommen waren N China CDC, N1 und N3 US CDC sowie RdRp IP2 und IP4 die sensibelsten Assays.


3.4. Erforschung von E Charité und N2 US CDC Falsch-Positive
Da E Charité und N2 US CDC Assays für alle Proben und Repliken positiv waren, einschließlich negativer Proben und Kontrollen, wurden falsch-positive Ergebnisse weiter untersucht (Zusatzabbildung S1).Für E Charité zeigten negative Proben zwei Amplikone, eines bei 84 Basenpaaren (bp) und eines mit 121 bp, während die positive Probe nur ein Amplikon bei 121 bp hatte, was nahe dererwarteten Größe einer spezifischen Amplifikation. Somit kann die mit E Charité erhaltene falsch-positive Amplifikation aus einer Kontamination (Amplicongröße bei 121 bp) abgeleitet werden, aber auch mit einer aspezifischen Amplifikation (Amplicongröße bei 84 bp) in Verbindung gebracht werden. Mit dem N2 US CDC-Test zeigten negative Proben ein Amplikon bei 73 bp, das nahe an der erwarteten Größe einer spezifischen Amplifikation liegt (Tabelle 1). Daher könnte die falsch-positive Verstärkung, die mit N2 US CDC erhalten wird, auf eine Kontamination zurückzuführen sein. Die Sequenzierung dieser Ampliconprodukte sollte zur weiteren Untersuchung durchgeführt werden.

4. Diskussion

In der vorliegenden Studie wurde die Leistung von fünf RT-PCR-basierten Methoden verglichen, die von Referenzlaboratorien entwickelt wurden.

N China CDC, N1 US CDC und RdRp IP2 und IP4 wurden als die empfindlichsten Assays auf SARS-CoV-2 Zellkultur bewertet und klinische Atemwegsproben gefunden. Vogels et al. verglichen die Leistung vonSARS-CoV-2 PCR-Assays, die von denselben Empfehlungslaboratorien entwickelt wurden, mit Ausnahme der vom Institut Pasteur. Anhand von RNA-spiked Mock-Samples fanden sie heraus, dass ORF HKU einer der sensibelsten Assays [18] war. Hierbei war die ORF HKU empfindlicher als rdRp Charité, aber etwas weniger empfindlich als andere Assays, wie N1 US CDC oder N China. Obwohl die RdRp Charité bei den niedrigsten Verdünnungen gut abgeschnitten hat, erwies sie sich dennoch als weniger empfindlich als andere, was im Einklang mit denen von Vogels et al. [18] stand.

Es ist erwähnenswert, dass der Charité-Assay der erste war, der im frühen Stadium der Pandemie [9] veröffentlicht wurde und weltweit weit verbreitet ist [8]. Dieser Test wurde ursprünglich für die Diagnose von SARS-bezogenen CoVs entwickelt und dann für die SARS-CoV-2-Erkennung optimiert [5]. Dank dieses Assays wurden eine bedeutende Anzahl von COVID-19-Diagnosen durchgeführt, die dazu beitrugen, die Ausbreitung des Ausbruchs zu begrenzen. Im Einklang mit den vorliegenden Ergebnissen wurde berichtet, dass die Empfindlichkeit von RdRp IP2 und RdRpIP4 ähnlich war, wenn sie in Multiplex verwendet wurde [14], was darauf hindeutet, dass der Institut Pasteur-Assay bevorzugt in Multiplex verwendet werden sollte. Bemerkenswert ist, dass wir die oben genannten Ct-Grenzwerte nicht angewendet haben, bei denen eine -Grenzwerte nicht angewendet haben, bei denen eine Stichprobe als negativ angesehen würde, da diese Werte in den von den Referenzlaboratorien zur Verfügung gestellten Protokollen nicht angegeben wurden.
Wie bereits berichtet [19], identifizierten wir eine wahrscheinliche Primerkontamination mit N2 US CDC und E Charité, die uns daran hinderte, ihre Empfindlichkeit und Spezifität weiter zu bewerten. Abgesehen von diesen beiden Tests wurden bei der Prüfung einer Vielzahl von Atemwegsviren keine falsch-positiven Ergebnisse beobachtet, ein Ergebnis, das mit früheren Studien übereinstimmte [5,6,10,11,13,14]. Obwohl hierin nicht beobachtet, wurde auch über die Verstärkung unspezifischer Produkte für ORF1 und N China CDC sowie N2 und N3 US CDC berichtet [18].
Die Leistung anderer kürzlich entwickelter RT-PCR-Tests [7] sollte in weiteren Studien untersucht werden. Darüber hinaus könnte die Quantifizierung von SARS-CoV-2 durchgeführt werden, um die Wirksamkeit potenzieller Behandlungen zu bewerten. Die hier in diesem Zusammenhang vorgestellten Daten sind von größter Bedeutung, um die Auswahl der Ausrüstung aller diagnostischen Laboratorien sowie die Entwicklung von vermarkteten Tests zu erleichtern. Sensible Tests sollten umfassend durchgeführt werden, um die Ausbreitung des derzeitigen Ausbruchs zu begrenzen und sich auf die postepisische Phase und künftige saisonale Epidemien vorzubereiten.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7355678/

Bisher dachte ich, die Apotheken hätten sich mit den Masken nur dumm verdient, aber nein:

https://www.gmx.net/magazine/politik/millionengeschaeft-apotheken-preis-6-euro-ffp2-maske-zustande-35726410